Western blot（也稱為蛋白質(zhì)免yi 印跡）是一種常用于研究中分離和鑒定蛋白質(zhì)的技術(shù)。它利用 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE) 來分離指定樣品中包含的各種蛋白質(zhì)，然后將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素或 PVDF 膜上，接下來將膜與對(duì)感目標(biāo)蛋白質(zhì)的特異抗體一起孵育。在洗膜過程中，未結(jié)合的抗體被洗掉，只留下與目標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體，zui 后通過顯影膠片或熒光掃描來檢測(cè)結(jié)合的抗體。原始樣品可為細(xì)胞、組織、培養(yǎng)上清、**沉淀或親和純化的蛋白，以下為定性檢測(cè)目的蛋白時(shí)細(xì)胞樣品的處理方法，其余的樣品制備方法參閱相關(guān)文獻(xiàn)。

1．培養(yǎng)細(xì)胞或藥wu 處理。

2．棄培養(yǎng)基，用1X PBS漂洗細(xì)胞2次，去盡殘留培養(yǎng)基。

3．加入1X SDS樣品緩沖液(6-well plate, 100 μl /w或 75 cm2 plate, 500-1000 μl/瓶)，刮落細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到Ep管。注意：冰上操作。

4．超聲 10~15秒剪切DNA以減低樣品粘性。

5．煮沸樣品5 minutes。

6．離心 12000g, 5 min，取上清。

7．電泳分離：上樣15μl~20 μl 至 SDS-PAGE 膠 ( 10 cm x 10 cm)電泳。

如要定量檢測(cè)某蛋白的表達(dá)水平，應(yīng)用RIPA裂解液(1 ml per 107 cells/ 100 mm dish/ 150 cm2 flask)裂解細(xì)胞，收集裂解液至離心管中，在振蕩器上混勻4～15min， 14000g離心15min（ 4℃），棄沉淀，用Bradford法或其它蛋白質(zhì)測(cè)定方法測(cè)定上清中蛋白濃度以調(diào)整上樣體積和上樣量，進(jìn)行Western雜交時(shí)還需設(shè)置內(nèi)或外參照，通常用beta-actin。

注意：一般上樣20~30 μg已足夠，如待檢蛋白為低豐度蛋白，可加大上樣量至100μg，但電泳條帶易拖尾，可制備亞細(xì)胞組份或采用更敏感的檢測(cè)方法。