使用無RNaseH活性(RNaseH-)的逆轉(zhuǎn)錄酶：

在逆轉(zhuǎn)錄反應中經(jīng)常加入RNase抑制劑以增加cDNA合成的長度和產(chǎn)量。RNase抑制劑要在第1鏈合成反應中，在緩沖液和還原劑(如DTT)存在的條件下加入，因為cDNA合成前的過程會使抑制劑變性，從而釋放結(jié)合的可以降解RNA的RNase。蛋白RNase抑制劑僅防止RNase A，B，C對RNA的降解，并不能防止皮膚上的RNase，因此盡管使用了這些抑制劑，也要小心不要從手指上引入RNase。

逆轉(zhuǎn)錄酶催化RNA轉(zhuǎn)化成cDNA。不管是M-MLV還是AMV，在本身的聚合酶活性之外，都具有內(nèi)源RNaseH活性。RNaseH活性同聚合酶活性相互競爭RNA模板與DNA引物或cDNA延伸鏈間形成的雜合鏈，并降解RNA：DNA復合物中的RNA鏈。被RNaseH活性所降解的RNA模板不能再作為合成cDNA的有效底物，降低了cDNA合成的產(chǎn)量和長度。因此消除或大大降低逆轉(zhuǎn)錄酶的RNaseH活性將會大有裨益。

SuperScriptⅡ逆轉(zhuǎn)錄酶，RNaseH- 的MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶及thermoScript逆轉(zhuǎn)錄酶，RNaseH- 的 AMV，比MMLV和AMV得到更多量和更多全長的cDNA。RT-PCR靈敏度會受cDNA合成量的影響。ThermoScript比AMV的靈敏性強得多。RT-PCR產(chǎn)物的大小受限于逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA的能力，尤其是克隆較大的cDNA時。同MMLV相比，SuperScripⅡ顯著提高了長 RT-PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。RNaseH- 的逆轉(zhuǎn)錄酶同時增加了熱穩(wěn)定性，所以反應可以在高于正常的37-42℃的溫度下進行。在建議的合成條件下，使用oligo(dT)引物和10μCi的 [α-P]dCTP。第1鏈的總產(chǎn)量使用TCA沉淀法計算。全長cDNA使用在堿性瓊脂糖膠上將大小分類的條帶切除并計數(shù)的方法分析。